植物抗性诱导被认为是保护作物免受极端高温（HT）影响的一种有前途的策略。然而，准确评估植物抗性诱导剂（PRIs）抗高温能力的快速高通量方法尚未开发出来。叶绿素a荧光（ChlF）作为一种无损技术，已广泛应用于农学、生态学、环境和植物科学等领域，特别是ChlF诱导动力学（OJIP）曲线为早期诊断提供了快速和精确的工具，以评估不同胁迫对植物生理状态的影响。
近期，南京农业大学陈世国教授团队提出了一种简单高效的方法，使用英国Hansatech公司生产的植物效率分析仪Handy PEA测定快速叶绿素荧光动力学曲线和JIP-test来评估新型天然植物抗性诱导剂—2-氨基-3-甲基己酸（AMHA）诱导植物（如拟南芥、番茄）叶片HT抗性的功效。学术论文“Fast chlorophyll fluorescence rise kinetics as a high-throughput diagnostic tool for evaluating the capacity of 2-amino-3-methylhexanoic acid at inducing plant resistance against high temperature”在线发表在Environmental and Experimental Botany上。研究结果如下：
1 高温下拟南芥叶片OJIP曲线受AMHA浓度的影响
OJIP曲线形状的变化与光合器官的生理状态相关，HT胁迫可以直接破坏PSII RCs中的放氧复合体（OEC），导致离开反应中心（RC）到受体侧的电子流与从OEC进入RC的电子流之间的不平衡，在OJIP曲线中约200~400μs处产生K-step。在室温（25℃）条件下，拟南芥叶片表现出典型的OJIP多相曲线。然而，在40℃ HT胁迫下，K-step成为一个主要的峰值，随后明显下降，直到I-step，然后一直持续到一个减弱的P-step，显示出O-K-J-I-P瞬态曲线（图1A，1B）。AMHA可以诱导植物对病原体和非生物胁迫的抵抗力。AMHA主要以剂量依赖的方式抑制了40℃ HT诱导的K-step的增加和P-step的减少。在1µM AMHA处理的叶片中，40℃高温诱导的K-step几乎被缓解，O-K-J-I-P瞬态的特殊上升也被避免，取而代之的是常规的OJIP瞬态曲线（图1B）。因此，AMHA可以缓解HT对PSII RCs OEC的损伤。然而，与1µM AMHA相比，AMHA在其*高浓度（10µM）下对缓解O-K-J-I-P瞬态曲线的效果较差，特别是对增加的K-step上。
为了量化AMHA对HT胁迫诱导的OEC损伤的影响，作者比较了O-J相间的标准化WOJ=（Ft–FO）/（FJ-FO）和O-J相间的相对可变荧光标准化ΔWOJ=WOJ（HT）-WOJ（未处理）（图1C）。40℃ HT处理的叶片ΔWOJ出现了明显的正K峰，但0.1µM和1µM AMHA有效地缓解了K峰。k峰的变化可以通过JIP-test参数WK来量化。当活性OEC的比例越高时，K峰就越低。k峰的振幅（ΔWK=WK（HT）-WK（未处理））在ΔWOJ中可以清楚地观察到（图1C）。与对照组相比，AMHA导致40℃HT处理的叶片k峰分别下降31%（0.01µM）、44%（0.1µM）、71%（1µM）和27%（10µM）。与其他浓度（尤其是1µM AMHA）相比，10µM AMHA对K峰的增加影响较小。作者推断，AMHA能有效地维持OEC的完整性，保护PSII的活性免受HT的胁迫。因此，可以建立一种基于叶圆片系统和OJIP曲线的方法，以评估AMHA诱导植物抗HT胁迫的活性。
图1.高温下拟南芥叶片OJIP曲线受AMHA浓度的影响
2 AMHA可缓解高温条件下拟南芥叶片OJIP曲线随温度而发生的变化先前的研究表明，仅在中度和重度HT胁迫下，OJIP曲线才会出现明显的K-step。本文中作者探讨了6个温度梯度下AMHA对拟南芥叶片OJIP曲线影响。在对照和1μM AMHA处理的叶片中，OJIP曲线的K-P相水平随温度升高而下降（图2A）。在除25℃外的不同HT胁迫水平下，AMHA处理的叶片的K-P相均高于对照样品（图2A）。与25℃相比，暴露在30℃以上温度下的叶片，无论是否存在AMHA或水，ΔWOJ都会随温度的升高而增加（图2B）。此外，在相同的HT条件下，与对照相比，AMHA处理使k峰分别下降了25%（35℃）、39%（38℃）、50%（40℃）和25%（42℃）（图2B）。在40℃高温胁迫下，AMHA完全消除了高温诱发的K-step，并明显抬高了OJIP曲线。然而，在42℃HT胁迫下，AMHA并不能明显缓解K-step出现（图2A，2B）。这说明42℃的危害太大，使得AMHA无法防止叶片中OEC的热损伤。因此，40℃是拟南芥叶圆片离体实验系统中评估AMHA诱导抗高温胁迫活性的一个更合适的高温胁迫条件。
为了进一步优化评估AMHA诱导HT抗性能力的温度，作者根据JIP-test参数PIABS与处理温度之间的关系建立了一个模型，以沿着拟南芥叶片温度梯度对HT胁迫程度进行分类（图2）。在所有超过50个JIP-test参数中，表示PSII整体光合活性的PIABS是对各种胁迫最敏感的参数。它可以作为植物活力的指标，并对胁迫敏感性水平进行排序。如PIABS对温度反应的排序图（图2C）所示，当温度升高到42℃时，以25℃为标准的PIABS相对值明显随温度升高而降低。根据相对PIABS值的下降百分比分为四个等级：无热胁迫的常温（20.7℃≤T≤26.4℃），PIABS下降不超过5%（0.95≤y≤1）；温和热胁迫温度(26.4℃<T≤33.1℃），PIABS下降5%至25%（0.75≤y<0.95）；中等热胁迫温度（33.1℃<T≤40.2℃），PIABS下降25%至70%（0.30≤y<0.75）；重度热胁迫温度（T>40.2℃），PIABS下降70%以上（0≤y<0.3）（图2C）。因此，本研究中使用的温度能有效地根据拟南芥植物的JIP-test参数建立可靠的热敏感性模型。
图2.AMHA对不同温度胁迫下拟南芥叶片OJIP曲线的影响
3 基于JIP-test特征参数的监测模型，用于监测AMHA诱导的耐热水平
不同胁迫对OJIP曲线的影响可通过五十多个JIP-test参数进行量化，以探究PSII结构、构象和功能状态的变化。热胁迫总是对某些JIP-test参数有显著影响，特别是那些由k-step得出的代表性参数。在所选的热响应参数中，FO和FM与温度升高显著相关，但除非温度上升到38℃或更高，否则水或AMHA处理的拟南芥叶片不会出现FO略有上升，FM大幅下降（表1）。所有与特定k-step直接相关的5个参数（FK、FK/FJ、VK、WK和OEC中心）都与HT的增加密切相关。FK值对低于40℃的轻度甚至中度热胁迫温度的敏感性不高。为了更好地分析HT对K-step的影响，作者引入了三个归一化参数FK/FJ、VK和WK来评估k-step的振幅。虽然FK/FJ被认为是评估热胁迫对PSII影响的潜在指标，但它并不能区分热敏感植物和耐热植物。VK和WK与处理温度高度正相关。与VK相比，WK对高温更敏感。在相同的高温条件下，与对照组相比，AMHA可以明显降低WK值（表1）。因此，可以观察到OEC中心与高温之间存在显著的负相关关系（表1）。根据相关性水平，作者选择了简单且易于从荧光OJIP曲线原始信号中得出的VK和WK作为热响应特征参数。此外，与OJIP曲线的IP相相关的3个参数（DVIP，δRo，和PITOT）也与温度呈显著正相关（表1）。IP振幅反映了电子在PSI周围的传递效率，以还原末端电子受体，对几种胁迫非常敏感。经水或AMHA处理的拟南芥叶片暴露于38℃或更高的HT时，DVIP和δRo都明显增加，表明中度或严重的热胁迫加快了PSI末端电子受体的还原速率，进而提高了潜在光合作用性能PITOT（表1）。然而，与VK和WK相比，这三个参数（DVIP，δRo，和PITOT）的温度相关性较弱（表1）。这可能是因为PSI比PSII更耐热损伤。因此，DVIP，δRo，和PITOT不适合评估植物的抗热胁迫抗性。
表1 1µM AMHA对不同高温下拟南芥叶片热响应JIP-test参数的影响
因此，作者*终选择PIABS和WK来建立一个模型，以确定拟南芥叶片经AMHA或水处理后的热敏感性。在对照（图3A）或1µM AMHA（图3B）的情况下，PIABS和WK与处理温度（25至42℃）之间的关系以三维图的形式表示，显示出非常高的相关性。与对照叶片相比，高温下AMHA处理的叶片中WK振幅的增加幅度较小，PIABS的下降速度较慢（图3A、3B）。考虑到WK与温度呈正相关，与PIABS相反，基于PIABS和WK（1/WK）的倒数，开发了一种新的超敏参数，以更好地量化PIABS和WK对温度的联合变化。这一合成参数PIABS/WK被定义为植物高温敏感性（Hs）的指标。根据归一化为25℃的PIABS/WK（Hs）对数值与高温之间的关系，建立了拟南芥叶片中AMHA诱导抗高温能力（Ci）的评估模型（图3C）。Ci值是根据log（Hs）归一化值50%抑制的温度（命名为I50）计算得出的：Ci=I50（AMHA）-I50（水）。I50值是通过log（Hs）与水和AMHA处理过的叶片中的升高温度之间的回归方程确定的。AMHA的Ci值为Ci=42.51-40.02(℃)=2.49℃。与对照相比，AMHA抑制了高温条件下log（Hs）的降低程度，尤其是在温度超过38℃时（图3C）。为了精确评估AMHA诱导耐高温的能力，根据计算出的Ci的温度范围将耐热性分为以下三组：低水平（0℃<Ci≤1℃）、中水平（1℃<Ci≤2℃）和高水平（Ci>2℃）。log(Hs)与升温之间的强负相关支持了Hs是衡量植物热敏感性的良好指标，因为其成分PIABS和WK的变化是与热胁迫下PSII生理状态直接相关的早期信号（图3C）。这种方法适用于区分拟南芥叶片经AMHA处理和经水处理后的抗热性差异。
为了进一步验证该模型，作者还根据参数Hs得出了不同浓度的AMHA在40℃HT下的相对刺激比（Kc）。暴露于40℃高温的拟南芥叶圆片中的相对刺激活性具有剂量依赖性的正效应（图3D）。AMHA的浓度为0.093μM，可产生相当于50%的反应（EC50）。作者最近的研究表明，在实验室和田间条件下，浓度为0.01至10μM的AMHA能显著增强几种植物对HT的抗性。因此，这种基于参数Hs的方法具有评估目标化合物诱导HT抗性活性的潜力。
图3.评估AMHA诱导拟南芥抗高温能力的模型
4 评估该模型在SA诱导的植物抗高温能力中的适用性
为了验证该模型是否适用于预测其他PRIs诱导的抗热活性，作者使用了公认的化学诱导剂水杨酸（SA）。SA作为一种信号分子可增强多种植物对生物和非生物胁迫（包括热胁迫）的抗性。
在本文的研究中，SA缓解了拟南芥叶片在40℃HT下OJIP曲线中K-P阶段的下降和K峰的出现，并对K峰水平表现出剂量依赖性（最高达200µM）的负面影响。不同浓度的SA明显减少了HT对PSII的OEC中心的损伤。在100µM SA的作用下，拟南芥叶片的OJIP曲线K-P阶段随温度升高而下降的趋势明显缓解，尤其是在38℃及更高的HT条件下。与对照叶片相比，SA处理叶片的K峰水平分别下降了约20%（35℃时）、63%（38℃时）、64%（40℃时）和43%（42℃时）（图4B）。这些结果与AMHA处理的叶片相似，但100µM SA保护OEC免受HT损伤的能力高于1µM AMHA（图2B）。在不同温度下，SA和AMHA对11个JIP-test参数的影响相似（表1）。与1µM AMHA相比，100µM SA的HT抗性诱导能力更强，因为SA的Ci值比AMHA高1.6℃。在0至200μM的范围内，Kc与SA的浓度呈明显的正相关（图4D）。SA的EC50为63µM，远大于AMHA的EC50，表明在HT胁迫下，AMHA的植物诱导能力强于SA。因此，此模型可以用来区分SA和其他PRIs诱导HT抗性能力。
图4.通过测定SA诱导拟南芥抗高温能力，进行模型适用性评估
5 通过植物存活和叶绿素荧光成像实验验证模型的可靠性
通过三种方法（植物存活率、叶绿素荧光成像和下胚轴伸长）进行的证实，AMHA和SA都能保护拟南芥植物免受高温胁迫（图5-7）。这与AMHA和SA通过维持PSII的效率显著提高植物抗热性密切相关（图3C、4C；表1）。因此，基于OJIP曲线分析和新的JIP-test参数Hs来评估AMHA诱导植物抗HT能力的高通量模型是非常可靠的。
图5. AMHA和SA减轻了拟南芥的高温损伤
图6.AMHA和SA对高温下两周龄拟南芥光合效率的影响
图7.AMHA和SA对高温条件下拟南芥幼苗下胚轴伸长的影响
6 使用该模型评估AMHA诱导番茄的高温抗性
为了确定该方法在不同物种中的适用性，作者选择了番茄来评估AMHA在诱导HT抗性方面的活性。在40℃高温处理下，在AMHA浓度从0.01µM到1µM的增加过程中，番茄叶片K峰值水平受到剂量依赖性的负面影响。与拟南芥相似，在番茄中，10µM的AMHA活性低于1µM，但高于1µM以下的浓度。将番茄叶片置于25至40℃的不同温度下，无论用水或1µM AMHA处理，K-P相水平都会随温度的升高而降低。在40℃高温条件下，对照叶片的OJIP曲线出现了明显的K-step。然而，与对照相比，AMHA大幅提高了K-P相水平，并降低了K-step振幅（图9A）。与对照组相比，AMHA处理的叶片的K峰分别显著降低了约43%（35℃时）、32%（38℃时）和30%（40℃时）。经AMHA处理的番茄叶片与对照番茄叶片在30℃高温下的K峰值水平无明显差异（图9B）。在不同温度的番茄叶片中，11个具有代表性的JIP-test参数都有显著的温度依赖性变化。这与AMHA和SA处理的拟南芥叶片的结果不完全一致（图2A、2B、4A、4B）。
图8.通过评估AMHA诱导番茄抗高温性的能力，进行模型验证
水和AMHA处理下番茄叶片I50值分别为40.05℃和43.89，Ci为3.84℃（图9C），几乎是高抗性阈值（2℃）的两倍。番茄中的EC50值为0.35μM，是拟南芥中AMHA EC50值的三倍多。因此，番茄植株需要更高浓度的AMHA才能达到拟南芥植株相同的诱导抗性水平。番茄似乎对HT比拟南芥更敏感。这也与作者的研究结果一致。显然，这种方法对于了解拟南芥和番茄以及其他可能的植物的AMHA诱导HT抗性的能力是可靠的。
结论
在本研究中，作者利用OJIP曲线技术量化PRIs诱导拟南芥叶片抗HT的能力。研究结果表明，AMHA主要通过减轻高温对OEC中心的损伤来维持PSII的整体活性，从而增强植物对HT胁迫的抗性。由新型JIP-test参数Hs得出的Ci和EC50是评估AMHA诱导HT抗性的有效指标。EC50越低，表明诱导HT抗性的能力越强。HT抗性诱导能力按Ci范围分为三类：低抗性（0℃<Ci≤1℃）、中抗性（1℃<Ci≤2℃）和高抗性（Ci>2℃）。与传统的植物存活率、叶绿素荧光成像和下胚轴伸长检测方法相比，基于Hs参数的新模型为PRI诱导HT抗性能力的量化提供了一种高效、可靠、廉价且易于使用的工具。因此，该模型有望作为一种高通量筛选方法，用于准确预测其他候选PRIs在不同植物物种中诱导HT抗性的能力。
图9 基于OJIP曲线和JIP-test分析技术评估AMHA诱导植物HT抗性的实验流程
