导读
在生命科学的微观世界里，纤维素作为植物和真菌细胞壁的关键构成要素，其在单细胞层面的纤维素等多糖代谢研究一直是科学家们聚焦的重要领域。然而，传统成像技术在这一研究进程中却遭遇了重重困境。传统的红外化学成像技术因分辨率的局限，无法对单个细胞中的纤维素进行成像；而纤维素等多糖本身又难以被荧光标记，这使得传统荧光显微镜也很难在植物和真菌细胞内的纤维素进行成像。如此一来，如何实现单细胞纤维素成像成为了该领域科研工作者亟待攻克的难题。
新型光学光热红外 (O-PTIR) 化学成像技术的蓬勃发展，大幅提升了传统红外化学成像法的空间分辨率，在亚微米空间尺度上实现对不同物质进行特异性的无标记化学成像。凭借该技术，科研人员不仅可以对单个植物、真菌细胞壁的纤维素等化学物质进行化学成像，还能通过红外光谱分析纤维素等化学物质的变化来判断该物质的生成或分解情况，为科研工作者提供更加丰富的纤维素等多糖的代谢信息。
新一代化学成像显微镜
美国PSC公司研发的新一代高分辨化学成像显微镜——mIRage，大大地拓展了光学显微镜的应用。mIRage不仅具备传统荧光显微镜的荧光成像功能，还采用新型光学光热红外（O-PTIR）技术，能够对物质的分子结构进行无荧光标记的化学成像，解决了传统化学成像空间分辨率低的问题，其化学成像分辨高达500 nm，可在亚微米尺度上对植物或真菌细胞壁的纤维素、多糖等多种物质进行成像与波普分析。这为植物代谢组学、植物细胞生物学等多个生命科学研究领域提供了新的表征手段。
新一代高分辨化学成像显微镜——mIRage
mIRage的特有优势：
• 亚微米空间分辨的红外光谱和拉曼高光谱成像（~500 nm）；
• 与透射模式相媲美的反射模式下的图谱效果；
• 非接触测量模式—使用简单快捷，无交叉污染风险；
• 很少或无需样品制备过程(无需薄片), 可测试厚样品；
• 可透射模式下观察溶液中的样品；
• 实现同时同地相同分辨率的IR和Raman测试；
• 荧光显微成像实现荧光标记样品快速定位。
mIRage部分应用领域
一、 mIRage助力植物细胞壁化学成像
在传统植物细胞成像中，通过光学成像可以观察到植物细胞壁的形貌特征，但是普通光学显微镜很难对组成细胞壁的纤维素、含羰基木质素、不含羰基木质素、羰基化合物等成分进行成像。而这些物质在细胞壁的内的分布、含量等信息对于植物代谢、根瘤研究等领域都有重要意义。
下图为mIRage对单个植物细胞的细胞壁进行的化学成像。通过对纤维素、含羰基木质素、不含羰基木质素、羰基化合物等多种物质对应的红外特征峰进行化学成像，可以得到整个植物细胞的细胞壁化学成像图片。可以清晰地表现出植物细胞壁的纤维素、木质素分布，并区分该木质素是否含有羰基。
下图为mIRage对单个洋葱上表皮细胞进行的化学成像。其中左图为洋葱上皮细胞的光学成像与化学成像图片。mIRage对单个洋葱上表皮细胞内的氨基酸、水、纤维素的特征峰进行了红外化学成像，可以明确地区分细胞壁与原生质体。同时可以对细胞特定区域分析红外光谱，获得更加详细的物质信息。
二、 mIRage协助分析番茄角质层化学性质与机械性能关系
角质层是一种多功能疏水性生物复合材料，可保护植物的地上器官。在植物发育过程中，植物角质层必须适应不同的机械约束，包括延展性和刚度，而其化学成分、结构异质性与机械性能的对应关系尚不清楚。
科研人员深入研究了番茄 (Solanum lycopersicum) 果实角质层从早期发育到成熟的纳米机械性能，以及与化学和结构异质性的关系，发现在果实发育过程中，角质层结构发生了微调，并通过mIRage化学成像协助证明了这些局部区域机械性能与化学和结构异质性的梯度相关性。
下图为科研人员使用mIRage化学成像结合AFM表征的番茄开花后 25天（DPA）角质聚合物基质横截面的信息，分析了从角质聚合物基质表面到表皮细胞表面的角质/多糖比率的梯度变化。结果显示，角质聚合物基质嵌入的多糖量对角质层的弹性模量有显著影响。脂质、多糖和酚类化合物与角质聚合物基质弹性模量在每个发育阶段都获得了统计学上显著的相关性。在结晶纤维素和果胶的弹性模量和拉曼强度之间观察到正相关性；相反，脂质和香豆酸的拉曼强度呈负相关；同时发现番茄成熟后，角质聚合物基质会积累酚类物质。
为了阐明角质层聚合物中央沟的具体机械性能及其与角质聚合物基质化学成分和结构的关系，在三个发育阶段（即 20、30 和 40 DPA）借助mIRage比较了中央沟和沟的侧面的化学成像信息（如下图所示）。20和30 DPA没有明显的角质信息，拉曼数据直到 40 DPA 阶段才显示出中央沟的强的角质特定光谱指纹，证明中央沟是由角质组成的，而多糖则逐渐被排除在侧面。沟边的酚类化合物与结晶纤维素的相对积累也发生了变化，而果胶则集中在中央沟边。上述数据表明，在番茄果实发育过程中，角质聚合物基质中央沟的化学成分与沟边略有不同。这些区域的脂质也观察到具有不同的大分子排列。
三、 mIRage助力真菌细胞化学成像
除了植物细胞外，mIRage还可以对真菌细胞进行化学成像。在一项针对能分解纤维素的外生菌根真菌Paxillus involutus研究中，科研人员在纤维素薄膜上培养外生菌根真菌Paxillus involutus，并对该真菌分解纤维素薄膜的过程进行了化学成像。
下图为mIRage对P. involutus菌丝尖端进行的化学成像。图C中可见纤维素背景，宽度约为 4.6 µm（图A中的绿色光谱和图C中的绿色区域），以及菌丝周围的纤维素分解区，该分解区从菌丝边缘延伸约 6.3 µm（图 A中的橙色光谱和图C中的橙色区域）。图C中蓝色区域显示的是未受真菌分解影响区域的化学成像。图B显示了用 mIRage采集的被研究细胞的可见光图像。图B中的红色矩形表示用mIRage成像区域即为图C区域。
在图A中的红外光谱中，1,100 cm-1至 950 cm-1波数区域的红外信号在靠近菌丝处减小；可以观察到该碳水化合物区域内光谱的明显变化。由于纤维素氧化导致的1,700 cm-1至1,600 cm-1红外吸收的增加可以与细胞内蛋白质肽键中C=O的变化导致的波普变化明显区分开来，综上数据表明：纤维素确实已被 P. involutus 氧化。
四、 mIRage高分辨率表征真菌细胞纤维素代谢
mIRage的高空间分辨率和光谱质量有助于更好地观察真菌纤维素分解区域化学物质的细微变化，用于更进一步地表征真菌的纤维素代谢过程。
下图利用新一代高分辨化学成像显微镜——mIRage对图A真菌的纤维素分解区进行了更加细致的波普分析：从菌丝的边缘绘制一组径向线（白色），并选择靠近这些线的像素（338 个绿点）进行进一步分析。图B显示了沿其中一条径向线上的不同采样点（及图A 中的不同彩色点）的单个光谱数据，表明纤维素分解区的红外光谱发生了逐渐变化。经过分析，可以发现未改变的纤维素随着距离菌丝的距离越远，含量越高（图C中蓝点），类似纤维素分解产物的含C = O化合物，随着距离菌丝的距离越远，含量越低（图C中橙色点）。而且2种物质在距离菌丝一定距离后（超出真菌纤维素分解区）物质含量基本持平。
总结
在以上案例中，mIRage展现了对单个植物细胞或真菌的化学成像能力。设备不仅可以对植物细胞壁中的纤维素进行成像，也可以对植物细胞壁中的木质素、羰基化合物、角质聚合物等多种物质进行特异性无标记成像。而且，在对真菌、植物细胞的化学成像过程中，mIRage的高分辨率还可以对细小部位（真菌纤维素分解区、角质层聚合物中央沟）内的同一物质的变化进行波普成像，更加准确地反馈特定物质的分布与化学变化。我们希望该技术将助力植物代谢组学、真菌代谢组学、植物学等领域的科研工作者做出重要贡献。
除了上述应用外，mIRage这一荧光、红外、拉曼三合一的化学成像显微还在多个科研领域有所应用：
1. 环境微塑料
微塑料颗粒（~600 nm）的O-PTIR光谱及成像分析
(引自Microscopy Today, 2022, 17, 3, 76-85)
2. 高分子材料
1210 cm-1处采集的PP/PTFE的O-PTIR光谱和显微图像
(引自Materials & Design, 211 (2021), 17, 110157)
3. 半导体
薄膜晶体管显示器中污染物的O-PTIR分析
器件表面缺陷的红外和拉曼光谱同步（同时间、同位置）分析
(引自Microscopy Today, 2020, 28, 3, 26-36)
4. 生命科学
脑组织的明场显微图像、O-PTIR光谱及成像分析
5. 文物鉴定
柯罗19世纪绘画作品中锌皂异质性的O-PTIR显微光谱及成像分析
(引自Anal. Chem. 2022, 94, 7, 3103–3110)
mIRage国内部分发表文章一览
☛ 中国农业大学借助mIRage成功实现对玉米粉中痕量微塑料的原位可视化表征。该工作发表在Science of the Total Environment上。
☛ 中科院过程工程研究所使用mIRage对利拉鲁肽微球的药物与载药颗粒的化学成分与空间分布进行了鉴定，该成果发表在ACS Applied Materials & Interfaces上。
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