铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞自噬的细胞程序性死亡 (programmed cell death，PCD) 方式，依赖于铁介导的氧化损伤，铁积累的增加，自由基的产生，脂肪酸供应与脂质过氧化物增加是诱导铁死亡的关键。
铁死亡的调控机制
关于铁死亡的调控，主要受 GSH/GPX4 途径的调节；铁代谢以及脂质代谢的相关通路也发挥着重要作用。
关于 GSH/GPX4 途径
图 1. GPX4 相关信号通路[1]
System Xc- 是一种广泛分布在磷脂双分子层中的重要的抗氧化体系，由两个亚基 SLC7A11 和 SLC3A2 组成的异二聚体。胱氨酸和谷氨酸通过 Xc-系统 以 1:1 的比例进出细胞交换，被吸收的胱氨酸 (Cystine) 在细胞中被还原为半胱氨酸(Cysteine)，并参与 GSH 的合成。
GPX4 是催化哺乳动物细胞中磷脂氢过氧化物 (PLOOH) 还原的主要酶。GPX4 将谷胱甘肽 (GSH) 转化为氧化型谷胱甘肽 (GSSG)，并将细胞毒性脂质过氧化物 (PL-OOH) 还原为相应的醇 (PL-OH)。因此，GPX4 活性的抑制可导致脂质过氧化物的积累。GPX4 表达下调的细胞对铁死亡更敏感，而 GPX4 表达上调则抑制铁死亡。GSH 在谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX) 的作用下减少 ROS 和活性氮。
此外，甲羟戊酸 (MVA) 途径通过调节硒代半胱氨酸 tRNA 的成熟来影响 GPX4 的合成，从而调节铁死亡的发生。
小贴士：Erastin作为最经典的铁死亡诱导剂，可抑制胱氨酸输入，影响 GSH 的合成，导致 GPX 活性降低，细胞抗氧化能力下降，脂质 ROS 积累，最终发生氧化损伤和铁死亡。
常用的铁死亡诱导剂RSL3直接作用于 GPX4 并抑制其活性，从而降低细胞的抗氧化能力并积累 ROS，导致铁死亡。
脂质过氧化与铁的积累
图 2. 脂代谢与铁死亡相关通路[2]
铁依赖性脂质 ROS 积累与所有途径的铁死亡有关。不受限制的脂质过氧化是铁死亡的标志。
游离多不饱和脂肪酸是合成脂质信号转导介质的底物，但它们必须被酯化成膜磷脂并被氧化才能传递铁死亡信号。脂氧合酶 (LOX) 和细胞色素 P450 氧化还原酶 (POR) 通过脂质的双氧合启动脂质过氧化。研究表明，磷脂酰乙醇胺是诱导细胞铁死亡的关键磷脂。酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4 (ACSL4) 和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3 (LPCAT3) 参与磷脂酰乙醇胺的生物合成和重构，激活多不饱和脂肪酸并影响其跨膜特性。因此，降低 ACSL4 和 LPCAT3 的表达可减少细胞内脂质过氧化物底物的积累，从而抑制铁死亡。
铁积累 (如增加铁吸收、减少铁储存和限制铁外流)可以促进铁死亡 (具体可见: 铁死亡是什么，如何检测？您要的“一文通”来了！)。过量的铁通过至少两种机制促进随后的脂质过氧化：通过铁依赖性 Fenton 反应产生活性氧 (ROS) 以及激活含铁酶。
铁死亡如何检测呢？
铁死亡的关键指标
铁死亡是由铁依赖的脂质过氧化驱动的，因此在铁死亡期间检测这种脂质过氧化是必要的。此外，线粒体在铁死亡期间通常表现出萎缩、致密的形态（因此可以通过检测线粒体来判断铁死亡)。此外，检测特定的基因表达变化：例如铁死亡的细胞中 TfR1 的上调及其重定位于质膜。下面小 M 来给大家介绍几种常用的铁死亡检测方式~
最常见的细胞表型检测
铁死亡会导致细胞死亡。因此一般在铁死亡的研究中，检测细胞活力是常见方法，同时也会通过染色等方法来观察细胞膜通透性，线粒体形态等。
如在Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis 一文中，作者研究抑制 Frataxin (FXN) 是否会促进铁死亡。用 Erastin 同时处理 FXN 敲低和对照细胞，12 小时后用 CCK8 法检测细胞活力，结果表明抑制 FXN 表达显著增强了 Erastin 诱导的细胞死亡。同时碘化丙啶(PI) 和 CFDA-SE染色结果以及用透射电镜观察到的线粒体碎裂、空泡化和嵴增大都表明 FXN 耗竭协同 Erastin 诱导铁死亡[3]。
图 3. 抑制 FXN 对 Erastin 诱导的 HT-1080 细胞铁死亡的影响[3]
A, 细胞暴露于不同浓度的 Erastin，检测细胞活力；B, Erastin 处理细胞 12 小时后用荧光显微镜观察 PI 阳性细胞；C, Erastin 培养细胞 3 天，用 CFDA-SE (5 μM) 染色，然后进行流式检测；D, 透射电子显微镜 (TEM) 检测线粒体的形态变化
亚铁离子的检测
细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一，亚铁离子积累可以特异性地增加氧化应激水平。例如，在研究氧化应激介导的视网膜色素上皮 (RPE) 变性的潜在机制时，通过用 FerroOrange 染色细胞 (亚铁离子探针)，结果表明 NaIO3和 Erastin 处理的细胞积累了过多的亚铁离子，说明诱导了铁死亡，而 Fer-1或 DFO 预孵育可以抑制亚铁离子的积累，如图 4 所示。结果表明铁死亡是氧化应激介导的 RPE 变性的主要病理过程[5]。
图 4. 通过 FerroOrange 染色评估亚铁离子水平[4]
活性氧 (ROS) 检测
ROS 和脂质 ROS 在铁死亡中起关键作用，文献报道增加的超氧化物歧化酶 (SOD) 可抑制体内的 ROS 水平。细胞内会由于铁的积累而抑制抗氧化系统，铁可能直接通过 Fenton 反应产生过量的 ROS，从而增加氧化损伤。因此 ROS 检测也是常用方法 (活性氧检测探针:ROS 探针大赛，你要的检测方法都在这里！)
Lin Li 在研究中发现羧基修饰的聚苯乙烯纳米粒子 (CPS) 可以增加细胞内 SOD 水平，因此推测 CPS 可能抑制铁死亡。实验结果表明，CPS 抑制了 RAW 264.7 中 Erastin 诱导的 ROS 升高 (图 5a, b)，并且比去铁胺具有更强的抗铁死亡作用 (图 5c, d)[5]。
图 5. CPS 有效抑制 RAW 264.7 细胞的铁死亡[5]
A-B, 在有无 CPS 条件下 Erastin 对 ROS 水平的影响；C-D, 在有无 CPS 或 DFO 条件下Erastin 对细胞活力的影响
脂质过氧化
除了 ROS 检测，铁死亡的脂质过氧化的指标还有谷胱甘肽 (GSH) 合成的变化、脂质过氧化物 (MDA, LPO) 水平的变化。
在遗传性血色素沉着症 (HH，一种铁超负荷疾病) 与铁死亡的关系研究中，为了证实铁死亡在 HH 相关肝损伤中的作用，作者用铁死亡抑制剂 Fer-1 治疗 Hjv–/–小鼠 (经典的 HH 小鼠模型) 和 Smad4 Alb/Alb 小鼠 (HH 样小鼠模型) 三周。如图 6 所示，与对照组小鼠相比，经 Fer-1 处理的小鼠肝脏 MDA 水平显著降低，NADPH 水平增加。此外，Fer-1 可以降低小鼠血清 ALT 水平胶原蛋白沉积。结果表明，铁超载会诱导 HH 小鼠的铁死亡[6]。
图 6. 铁死亡抑制剂 Fer-1 可减轻 HH 小鼠中铁过载引起的肝损伤[6]
用或不用 Fer-1 治疗的野生型、Hjv–/–、Smad4Flox/flox和 Smad4Alb/Alb 小鼠中, A, 肝脏 MDA 含量；B, 肝脏 Ptgs2 mRNA 水平；C, 肝脏 NADPH 含量；D, 血清 ALT 水平
谷胱甘肽代谢
在 DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase一文中，作者探究了 DJ-1 负调节铁死亡的机制。研究发现，用 RNA 干扰抑制 DJ-1 表达可以与 Erastin 协同抑制细胞内 GSH 水平 (图 7A)。同时，添加外源性 GSH 或 N-乙酰半胱氨酸 (NAC) 可以逆转 Erastin 诱导的脂质 ROS 积累 (图 7B) 和细胞死亡 (图 7C)。因此，作者推测 DJ-1 可能会影响 GSH 的合成从而抑制铁死亡[7]。
图 7. DJ-1 通过抑制 GSH 水平负调节铁死亡[7]
A, Erastin 处理DJ-1 KD H1299 细胞 6 h 后 GSH 水平；
B, 在有无 GSH 或 NAC 条件下细胞用 Erastin 处理细胞 12 h 后脂质 ROS 水平；C, 用Erastin 处理细胞 36 h 后，测定细胞活力
总结：
铁死亡受细胞内信号通路的严密调节，既包括铁稳态的调节通路,更有铁代谢以及脂质代谢相关通路等。
但是各个通路相辅相成，互相影响。调控途径不同， 检测的指标也十分多样化，小伙伴们在实验过程中，检测方法可要多打 “组合拳”！
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参考文献
1. Jiang X, et, al. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021 Apr;22(4):266-282.
2. Chen X, Kroemer G, Tang D, et, al. Broadening horizons: the role of ferroptosis in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 2021 May;18(5):280-296.
3. Du J, Zhou Y, Li Y, Tong X, Wang Y, et, al. Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis. Redox Biol. 2020 May;32:101483.
4. Tang Z, Ju Y, Dai X, Zhang J, Gu P ,et, al. HO-1-mediated ferroptosis as a target for protection against retinal pigment epithelium degeneration. Redox Biol. 2021 Jul;43:101971.
5. Wang H, et, al. Characterization of ferroptosis in murine models of hemochromatosis. Hepatology. 2017 Aug;66(2):449-465.
6. Li L, et, al. Polystyrene Nanoparticles Reduced ROS and Inhibited Ferroptosis by Triggering Lysosome Stress and TFEB Nucleus Translocation in a Size-Dependent Manner. Nano Lett. 2019 Nov 13;19(11):7781-7792.
7. Cao J, et, al. DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase. Nat Commun. 2020 Mar 6;11(1):1251.
