单细胞测序在疾病诊断和细胞异质性研究中发挥着重要作用，单细胞测序已经让我们能以全新的方式理解细胞的生化过程。然而目前的单细胞测序手段需要将细胞消化并裂解才能够进行，而细胞状态在这一操作中不可避免的会发生改变，因此很难掌握细胞真实的基因表达情况。近日，来自中国科学院深圳先进技术研究院研究员陈万泽以第一作者身份在国际期刊Nature上发表长文，使用多功能单细胞显微操作系统FluidFM创建了一种原位活细胞基因测序方法Live-Seq，这种方法能够在不杀死细胞的情况下完成对细胞的测序工作。通过这种技术该团队成功完成单细胞RNA基因测序，并通过这种方法检测到了细胞的基因表达和细胞周期状态变化。下面本文就这项工作的具体内容进行阐述。
1. Live-Seq测序技术简述
由于单个细胞的RNA总量仅有10 pg。为了实现无损的单细胞测序，陈老师的团队首先使用FluidFM对现有的scRNA-Seq单细胞测序的方法进行了优化。为了尽可能的接近Smart-Seq的测试条件，团队采用了首先将缓冲液吸入探针，然后再进行细胞提取的操作。这样可以确保所提取的RNA能够第一时间与缓冲液混合，从而避免RNA的降解。通过这一方法，该团队成功实现了IBA细胞的测序，证明了这种方法的可行性（图1）。
图1. Live-Seq技术
a. Live-Seq技术的示意图和代表图片，黑色箭头指液体位置；b. IBA细胞测序的质量控制图（n=10）。
2. Live-Seq技术分析细胞系和细胞状态
为了证实Live-Seq的有效性，陈老师团队对多种细胞系进行了测序，这其中包括IBA细胞、小鼠脂肪干细胞和祖细胞（ASPCs）以及脂多糖处理的RAW264.7细胞和Mock处理的RAW264.7细胞。通过对这些细胞系进行测序发现，该方法能够区分上述细胞系，并且在特征基因检测中能够找到每种细胞所对应的特征基因，证明了Live-Seq方法的有效性（图2）。
图2. Live-Seq单细胞测序区分细胞型及细胞状态
3. Live-Seq技术对细胞的活力基本没有影响
Live-Seq技术的优势在于提取过程中不会破坏细胞。通过对提取前后的测序对比可以发现，提取组与空白组之间的团簇没有显著性差异。并且通过对细胞形态的观察中，发现细胞的形态基本没有改变，并且多数细胞仍然能够正常分裂（图3）。
图3. Live-Seq对细胞活力的影响
a. 细胞实验的示意图；b. Live-Seq测序后不同时间点（1h,4h）的scRNA-Seq的tSNE图；
4. Live-Seq技术能够记录细胞下游分子表型事件
由于Live-Seq对细胞生理状态影响小，因此能够监测在细胞代谢过程中的基因变化。通过对比LPS处理的巨噬细胞周期实验中发现，Live-Seq技术与对照组的细胞代谢水平相比没有明显变化，因此这种方法测量的数据十分接近细胞代谢中基因表达的真实水平。通过测序对比LPS处理与空白的测序结果发现Nfkbia与Tnf的表达非常相关。这一结果也验证这种测序方法在检测细胞下游表型时的优势。
图4. Live-Seq技术的单细胞纵向分析
5. Live-Seq技术对同一细胞多次测序
Live-Seq技术的无损性甚至能够实现对单个细胞的多次测序。通过对单个细胞两次提取后细胞活力变化的观察中发现，细胞的活力即使在2次提取后仍没有发生明显的变化，基因型分析也没有发现明显的基因表型改变。
图5. Live-Seq对细胞的多次提取，连续测序的示意图和代表图像；整合Live-Seq和scRNA-Seq的tSNE图。
6. 总结
Live-Seq是一种十分具有前景的单细胞测序的新方法，得益于FluidFM技术的无损提取的优势，Live-Seq技术除了能够实现传统测序的功能外，还降低了细胞的损伤，能够提供更加原生和真实的测序信息。这种特点甚至让单细胞的基因表达动力学研究成为可能。相信随着这种技术自动化的提高，将为单细胞测序技术带来更多可能。
参考文献：
[1] Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells, Wanze Chen, Orane Guillaume-Gentil, Pernille Yde Rainer, Christoph G. Gäbelein, Wouter Saelens, Vincent Gardeux, Amanda Klaeger, Riccardo Dainese, Magda Zachara, Tomaso Zambelli, Julia A. Vorholt, Bart Deplancke, Nature(2022); DOI: 10.1038/s41586-022-05046-9
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