外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，是细胞间信号传输的载体。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，它们广泛存在于血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁等体液中，参与细胞间通讯。近年来，外泌体的研究热度持续攀升，在2019年国家自然科学基金获批项目中，外泌体研究相关项目的总数突破500个，立项的总金额突破2亿元。但由于外泌体的尺寸（30~200 nm），常规的光学显微镜无法对其进行成像分析，因此很少有技术能够对单个外泌体进行物理表征和蛋白分型。
美国NanoView Biosciences公司推出了全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView系统，采用了SPIRS成像技术，只需要少量样品即可一次完成外泌体计数、粒径、蛋白表达、蛋白共定位、亚群分布的分析。全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView于2018年被推出后，便引起了外泌体领域科研工作者的广泛关注，目前在全球已近100多个实验室采用该技术，发表文献超过150篇。进入2022年，使用ExoView发表的论文出现井喷性增长，短短数月已经发表了近50篇。本文选取了三篇在高水平期刊《Journal of Extracellular Vesicle》（JEV）发表的比较有代表性的文章，来说明ExoView在血样本、光诱导、心功能不全等研究领域的具体应用。
四跨膜蛋白区分人血清和血浆中不同外泌体亚群-血浆中血小板外泌体的贡献
早期研究证明从血液中分离外泌体的能力对于将外泌体开发为疾病的生物标志物至关重要，尤其是从血浆和血清中分离外泌体，但很少有研究系统地比较这些来源的外泌体类型。Nasibeh Karimi等[1]对确定血浆和血清中不同外泌体亚群的存在进行了研究。研究人员采集健康受试者血液，分别用 K2E EDTA 采血管和 ACD-A采血管收集血浆，同时用血清凝块激活剂管收集血清，然后利用ExoView、Western blot、ELISA 和质谱等技术分析分离出的外泌体亚群。结果表明人类血液中含有多个携带不同四跨膜蛋白的外泌体亚群，使用不同的抗凝剂和离心方法，会影响外泌体亚群的分析。
其中，研究人员使用ExoView对从血浆（EDTA）、血清以及人肥大细胞系分离的外泌体进行检测，结果显示在血浆和血清的样本中，血小板蛋白CD41a抗体捕获较多的是CD9+外泌体。与血清相比，血浆中的CD9+外泌体更多，并且是从血小板释放的（图1 a,b,c），然而血清中的CD63+/CD41a+外泌体的数量高于血浆（EDTA）（图1 m,n），这与之前的磁珠ELISA法的结果保持一致。另外，在血浆、血清样本中，被CD81抗体捕获的外泌体的CD63+比例较低，而CD9+比例较高（图1 a,b,d,e,g,h），进一步验证了早先的研究结果，但是在人类肥大细胞系的样本中，研究人员没有观察到这种差异（图1 c,f,i,l）。另一方面，粒径分析的结果显示CD41a和CD9抗体捕获的外泌体的粒径相对较小，表明捕获的外泌体是单外泌体，而不是外泌体聚合物（图1 o）。
图1 ExoView检测从血浆、血清、人肥大细胞系分离的外泌体的数量、共定位和粒径
光诱导免疫功能外泌体的高效产生
基于外泌体的治疗方法和疫苗正在不断兴起，然而基于临床应用剂量规模的研发始终是一个巨大的瓶颈。为了克服这样的障碍，Shaobo Ruan[2]等开发了一种简单直接的方法，通过利用近紫外LED灯（365 nm）的光感应来促进树突状细胞分泌外泌体 (DEV)。体外和体内实验的结果显示，近紫外波长不会损害细胞生长，使DEV生产率提高了13倍以上，同时让DEV保持了良好的生物相容性和高度免疫性，使其成为理想的治疗平台。
其中，研究人员使用ExoView对DEV的免疫性标记物进行检测，把样品组分为未处理的成熟树突状细胞来源的外泌体（mDEVs）、未处理的未成熟树突状细胞来源的外泌体（imDEVs）、近紫外光照射的成熟树突状细胞来源的外泌体（UV-mDEVs）、近紫外光照射的未成熟树突状细胞来源的外泌体（UV-imDEVs）。结果显示在所有的分组中，CD9抗体捕获的外泌体数量始终比CD81抗体捕获高4倍多，这表明大多数DEV具有CD9表达，但可能不具有CD81表达（图2 b,c,d)。CD63是外泌体中常见的结构和功能蛋白，这使得CD63+外泌体数量远高于MHC-I+、MHC-II+、CD86+。以CD63作为内部参考，研究人员进行了两次平行实验以评估MHC-I/MHC-II与CD86的表达水平(图2 c,d)。使用归一化方法计算总捕获DEV的生物标记物的相对百分比，结果表明mDEVs的MHC-I、MHC-II和CD86表达略高于imDEVs的表达（图2 g,h）。该结果与早先研究结果一致，即mDEVs具有更强的免疫反应诱导性。此外，CD63/MHC-I/CD86、CD63/MHC-II/CD86、MHC-I/CD86、MHC-II/CD86或CD63/CD86的共表达在不同的 DEV条件下以及有或没有进行光处理没有明显变化，尽管单独的MHC-I或MHC-II在光处理后表现出轻微的减少（图2 e,f），这证明光诱导对DEV的免疫标记表达几乎没有影响。在 DEV上保留必要的免疫标志物对于免疫反应至关重要。
图2 ExoView检测mDEVs、imDEVs、UV-mDEVs、UV-imDEVs的免疫性标记物的数量、共定位以及进行荧光成像
含miR-421的外泌体与空气污染（PM2.5）诱导心功能不全的发生机制相关
大气细颗粒物（PM2.5，空气动力学直径≤2.5μm）是空气污染的主要原因。越来越多的证据表明，大气PM2.5浓度的升高与总死亡率呈正相关，尤其是心血管疾病和呼吸系统疾病的死亡率。 PM2.5急性/亚急性暴露对人体的危害不容忽视，但是对于呼吸系统亚急性暴露于PM2.5所诱发心脏功能不全的分子机制尚不明确。上海大学王红云[3]等在大气污染相关的心血管疾病研究方面取得新进展，揭示了大气PM2.5亚急性暴露引发心功能不全的新的分子机制：大气PM2.5亚急性暴露在肺损伤后促进外泌体释放其携带的miR-421，通过抑制ACE2导致 PM2.5诱导的心功能不全。
其中，研究人员使用ExoView对从暴露于PM2.5的细胞上清液提取的外泌体以及对照组进行检测。结果显示，与对照组相比，PM2.5组的外泌体数量显著比对照组多（图3 a）。另外，粒径的结果显示了两组外泌体的粒径大小接近（图3 d）。多色荧光成像图表明，与对照组相比，PM2.5暴露增加了 CD63/CD81/CD9 共定位外泌体的数量（图 3 c）。这些数据证明了PM2.5 暴露可显着增加CD63+、CD81+和CD9 +外泌体。
图3 ExoView检测从暴露于PM2.5的细胞上清液提取的外泌体和对照组外泌体的计数、粒径以及进行荧光成像
在上述三篇文章中，科学家借助美国NanoView Biosciences公司研发的全自动外泌体荧光检测分析系统ExoView，直接检测样本中的外泌体，无需纯化，操作简单。一次结果直接输出外泌体粒径，数目，蛋白表型，不同亚群的含量、多色荧光成像图。三篇文章分别从血样本、光诱导、心功能不全等研究领域介绍了ExoView的无需纯化，全面表征的特点，有力地证明ExoView是外泌体检测的一大利器。
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☛ 上海大学在《Journal of extracellular vesicles》发表文章。
☛ 中国科学院深圳技术研究院在《Lab on a Chip》发表文章。
☛ 北京天坛医院、国家纳米科学中心、北京航空航天大学在《Advanced Science》发表文章。
☛同济大学附属上海市肺科医院、上海思路迪转化医学在《Journal of Nanobiotechnology》发表文章。
☛ 山东千佛山医院在《NANO LETTERS》发表文章
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参考文献：
[1] Nasibeh Karimi, Razieh Dalirfardouei, Tomás Dias, Jan Lötvall, Cecilia Lässer. (2022) Tetraspanins distinguish separate extracellular vesicle subpopulations in human serum and plasma – Contributions of platelet extracellular vesicles in plasma samples. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12213.
[2] Shaobo Ruan, Nina Erwin, Mei He. (2022) Light-induced high-efficient cellular production of immune functional extracellular vesicles. Journal of extracellular vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12194.
[3] Hongyun Wang, Tianhui Wang, Wei Rui, Jinxin Xie, Yuling Xie, Xiao Zhang, Longfei Guan, Guoping Li, Zhiyong Lei, Raymond M Schiffelers, Joost P G Sluijter, Junjie Xiao. (2022) Extracellular vesicles enclosed-miR-421 suppress air pollution (PM2.5)-induced cardiac dysfunction via ACE2 signaling. Journal of Extracellular Vesicles, https://doi.org/10.1002/jev2.12222.
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