【研究背景】
血管生成是指从现有血管中内皮细胞生长而生成新的血管，一旦血管开始生成，被称为尖 端细胞的特殊内皮细胞就会开始发芽过程。由此，血管芽内皮尖 端细胞的长出标志着血管生成的开始，这一过程在生理学和病理生理学过程中至关重要。然而，细胞外基质（ECM）的机械特性如何调节尖 端细胞的形成在一定程度上被忽视了。尖 端细胞的特性是血管生成和组织工程的关键，它可以定向迁移到无血管区域，对zui终形成的血管形态起决定作用。迄今为止，各种生化信号分子因素如 MST1-FOXO1等多见报道，然而功能血管的建立需要生化和生物力学信号线索的结合，后者取决于组织工程和再生医学中使用的生物材料的特性。
近期，北京大学口腔医学院的郭亚茹博士以第 一作者在Bioactive Materials发表了题为：Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis的研究文章。文章报道了基质硬度通过p-PXN-Rac1-YAP信号轴调节尖 端细胞形成，这项工作不仅有助于在组织工程和再生医学中寻找至佳材料，也为肿瘤治疗和病理性血管再生提供了新的治疗策略。在生物材料设计和治疗一些病理情况方面具有特殊意义。邓旭亮教授为本文通讯作者。
【研究概述】
在这项研究中，作者研究了基质硬度对尖 端细胞形成的影响，并探索了基础机制。在肝癌细胞的外层发现CD31表达更高，组织硬度也更高。基质的硬度增加可以显著增加血管的生成和尖 端细胞富集基因的表达。硬度较大的基质增加了FAK和p-PXN的局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，进而导致细胞骨架组织和细胞刚度增加。随后，YAP作为下游的力效应因子被激 活并易位入核，上调靶基因的表达，zui终促进尖 端细胞的形成。p-PXN还可以减少细胞间的连接，从而促进尖 端细胞的形成。由此表明：基质硬度可通过p-PXN-Rac1-YAP信号轴调节尖 端细胞的形成。
【研究结果】
硬度的增加还可以促进血管的生成（图1D），从三维（3D）EC球体（图1E）的芽入侵距离增加可证明这一点。与GM60和GM30凝胶（图1F）相比，硬凝胶（GM90）中球体的芽数量增加了2倍。qPCR分析表明，尖 端细胞富集基因，包括CD34、VEGFR2、DLL4、CXCR4、EFNB2和IGF2，在GM90基质（图1G）中显著上升。同时，更硬的凝胶中芽的宽度更厚，矩阵中含有更多和长的纤维状体（图1H和I）。由此数据表明，基质硬度增加可以促进血管生成和尖 端细胞的形成。
图1. 基质硬度增强血管生成和尖 端细胞在体外和体内的形成。
在EC球形发芽模型中，从球体中产生的zui外层细胞和以下细胞分别被定义为尖 细胞和茎细胞。未爬出球体的细胞被定义为密集细胞（图2A）。通过原子力显微镜（AFM），我们检测到每个细胞的16个位置，并制作了典型的力学热图（图2B）。尖 端细胞的刚度在数量上是茎细胞的两倍，是咽细胞的四倍（图2C）。此外，免疫荧光染色表明，尖 端细胞显示长应力纤维的增强组装，而在茎和密集细胞作用捆绑是相对较短的，并限制在细胞外围（图2D）。研究人员发现尖 端细胞中的YAT显示出明显的核定位，而YAT在咽细胞（图2D和E）中成为细胞质。通过免疫荧光、多功能单细胞显微操作系统FluidFM技术和原子力显微镜AFM，发现细胞扩散区域增加（图3A），粘附力（图3B和C）和细胞硬度（图3D），这表明 EC-ECM 连接增加，并通过 ECM 硬化提升细胞机械特性。另外，VP（YEP抑制剂）治疗显著降低了EC球体的延伸次数和芽入侵距离（图2F和G）。尖 端细胞富集基因也被VP（图2H）抑制。因此，可以推断基质硬度调节了ECs的细胞机械感知和机械传输，促进了YAC活化，zui终增强了尖 端细胞的形成。
图2. 尖 端细胞、茎细胞和密集细胞的机械特性差异。
图3. FluidFM粘附力检测过程示意图。
在确定了血管生成和尖 端细胞形成中EC亚型之间的机械差异后，作者探讨了ECM刚度通过PXN磷化调节尖 端细胞的形成，验证了 p-PXN 在硬 ECM 诱导尖 端细胞规范中的参与程度，进而推断，通过基质硬化强加的尖 端细胞形成需要PXN磷酸化。随后，作者验证了p-PXN-Rac1-YAP激 活在ECM僵硬诱导尖 端细胞形成和血管生成体内的作用，研究人员通过在裸鼠体内皮下注射 HepG2 细胞创建肿瘤模型，并从第 8 天起每天使用 VP 治疗一次（图4F）。4周后，在肿瘤胶囊（图4G）上发现发芽较少的血管，CD31、CD34和VEGF强度（图4H，图4I ）。VP治疗减少肿瘤体积（图4J）。这些数据表明p-PXN-Rac1-YAP信号轴与ECM硬化促进的尖 端细胞形成和血管生成有很大关系。
图4. p-PXN-Rac1 通过激 活 YAP 促进尖 端细胞的形成和血管生成。
图5. 发芽血管生成受ECM硬度影响的潜在机制的示意图。
综上，基质的硬度增加可以显著增加血管的生长、发芽和尖 端细胞富集基因的表达。硬度较大的基质增加了FAK和p-PXN在局灶黏附，提高了活性Rac1的水平，进而导致细胞骨架组织和细胞刚度增加。随后，YAP作为下游的力效应因子被激 活并易位入核，上调靶基因的表达，zui终促进尖 端细胞的形成。
【研究意义】
本研究加深了我们对尖 端细胞形成和血管生成机理的理解，有助于优化组织工程和再生医学的生物材料设计，为一些病理情况提供新的治疗策略。无论是组织工程还是血管再生，都应考虑机械特性，如针对尖 端细胞形成的刚度，以设计至佳功能生物材料。此外，ECM可以在许多病理状态下变硬，如癌症的发展过程，随着变硬癌周围尖 端细胞数量的增加，迫切需要靶向p-PXN、Rac1或YAP的药物来有效防止肿瘤的生长和转移。
【研究利器】——FluidFM技术在生物活性材料领域的创新应用
本实验研究人员采用了多功能单细胞显微操作系统——FluidFM技术，实现了单个细胞的分离，单个细胞粘附力的测量。瑞士Cytosurge公司多功能单细胞显微操作系统——FluidFM，是集原子力系统、微流控系统、细胞培养系统为一体的单细胞操作系统。主要功能包括单细胞注射、单细胞提取、单细胞分离、单细胞粘附力的测定、生物3D打印等。实验中FluidFM探针以3 μm/s靠近细胞，设定力为100 nN。当探针连接到到达设定点的细胞时，在探针中施加-650 mbar 的力，并保持5 s，以确保细胞被探针完全抓取。然后，在保持-650 mbar的压力，以1 μm/s的速度将探针抬高至100 μm的高度，从而将细胞从基板上完全分离。FluidFM系统完全记录了每个单细胞的Z轴高度和力距离曲线，并分析其粘附强度。每个条件下至少测量并获得20个力距离曲线。所有细胞粘附测量实验过程都是在 37 °C在5% CO2细胞培养环境下进行。
图6. FluidFM进行单细胞分离示意图。
图7. FluidFM进行单细胞力谱测定示意图。
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【参考文献】
[1] Y. Guo, F. Mei, Y. Huang, S. Ma, Y. Wei, X. Zhang, M. Xu, Y. He, B.C. Heng, L. Chen & X. Deng. Matrix stiffness modulates tip cell formation through the p-PXN-Rac1-YAP signaling axis. (2021) Bioactive Materials.
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