从完整肌腱到单纤丝：偏振红外光谱强势助力胶原蛋白的分子取向研究

　　在过去的十年里，红外（IR）光谱已被广泛应用于哺乳动物组织中的胶原蛋白研究。对有序胶原蛋白光谱的更好理解将有助于评估受损胶原蛋白和疤痕组织等疾病。因此，利用偏振红外光研究胶原蛋白（I型胶原和II型胶原）的层状结构和径向对称性逐渐成为研究热点。目前，基于焦平面阵列检测器的偏振远场（FF）傅立叶变换红外（FTIR）成像、偏振远场（FF）、光学光热红外（O-PTIR）以及散射型扫描近场光学显微镜（s-SNOM）的纳米红外技术在胶原蛋白领域得到广泛应用。偏振远场（FF）方法可应用于完整肌腱的截面，其纤维平行且垂直于偏振光排列。光学光热IR红外（O-PTIR）和纳米傅立叶变换红外（nano-FTIR）方法则应用于直径为100~500 nm的原纤维，在生物聚合物上共同实现互相印证和互补的结果。

　　通常，I型胶原蛋白在偏振红外光下反应不同。采用基于焦平面阵列（FPA）检测的远场傅里叶变换IR（FF-FTIR）对其进行成像时，受制于蛋白质酰胺I和II的红外特征峰吸收带的波长（~7 μm）的分辨率限，难以获取高质量的成像结果。而采用散射型扫描近场光学显微镜（s-SNOM）方法的纳米FTIR（nano-FTIR）光谱技术，可以获得空间分辨率约为20nm的红外光谱，解决了受限于IR辐射波长的限制（通常5-10 μm）。此外，采用光学光热红外技术（O-PTIR）成像和光谱学的方法，也可以摆脱红外波长的限制，实现亚微米（500nm）的空间分辨率，为完整组织和原纤维胶原蛋白的研究打开了一个新窗口。

　　近期，在Kathleen M. Gough等人的研究中^[1]，作者采用基于光学光热红外（O-PTIR）技术的PSC非接触亚微米分辨红外拉曼同步测量系统 mIRage对样品〜500 nm单点区域收集振动光谱，如图1所示。该光学光热红外（O-PTIR）技术的工作原理是光热检测，其中红外量子联激光器（QCL）激发样品在1800–800 cm^-1光谱范围内的分子振动。产生的光热效应通过短波长探测激光器检测。图2A-B中的光谱表明，固有的激光偏振所获得的高对比度所产生的光谱与使用FTIR焦平面阵列和偏振器组合进行的光谱测试近乎一致。并且对于安装在玻璃显微镜的不同载玻片，样品均获得了具有良好SNR的高质量光谱。

图1. 完整肌腱的光学光热IR（O-PTIR）光谱，〜500 nm测量点。（A）利用线性偏振量子联激光器（QCL）从CaF₂窗口在平行和垂直两个不同方向上获得光谱。插入的可视图像显示了6个采谱位置；比例尺= 70 µm。（B）对比从CaF₂（顶部）和玻璃（底部）载玻片在线性偏振QCL的平行和垂直方向上获得的光谱。

　　光学光热红外（O-PTIR）技术可以通过在载物台上轻易地旋转样品来测试平行和垂直于红外激光偏振方向的光谱。并利用光学光热红外（O-PTIR）技术在几个单一频率下对原纤维成像，以获得表观物理宽度的确定性估计。如图2右侧所示，在垂直方向上， 1655 cm^-1处记录的单波长图像的红黄带表明该原纤维的宽度不超过500 nm。该尺寸将目标物标定为真正的原纤维，并且可与红外s-SNOM实验中检测到的300 nm原纤维相当。光学光热红外（O-PTIR）技术与nano-FTIR的测试结果相互印证，反映了“原纤维”宽度的标准范围。此外作者观察到，来自原纤维的酰胺I和II谱带比完整肌腱的窄，并且相对强度和谱带形状都发生了变化。这些光谱反映出在偏振红外光下正常I型胶原纤维的更多有用信息，并可作为研究胶原组织的基准。

图2. 从CaF₂窗口利用O-PTIR测试控制肌腱原纤维获得的光谱。用平行于激光偏振的原纤维获得的顶光谱（红色）；蓝色是垂直方向上的光谱。右侧是在垂直方向基于1655 cm^-1的单波长图像。正方形表示光谱采集位置。比例尺= 1 µm。

　　与基于焦平面阵列检测器的偏振远场傅立叶变换红外（FF-FTIR）光谱相比，光学光热红外（O-PTIR）具有更高的空间分辨率，且可提供单波长光谱。使用FF-FTIR FPA探测往往包括其他非胶原材料。同时，光学光热红外（O-PTIR）还可以提供偏振平行于原纤维取向的原纤维光谱。这也是光学光热红外（O-PTIR）和纳米FTIR光谱对直径为100~500 nm的胶原原纤维给出证实性和互补性结果的次证明。综上所述，这些结果为进一步研究生物样品中的胶原蛋白提供了广阔的基础。

　　参考文献：

　　[1]. Gorkem Bakir, Benoit E. Girouard,  Richard Wiens, Stefan Mastel, Eoghan Dillon, Mustafa Kansiz, Kathleen M. Gough, Molecules 2020, 25, 4295; doi:10.3390/molecules25184295.

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