凯氏定氮仪是根据蛋白质中氮的含量恒定的原理，通过测定样品中氮的含量从而计算蛋白质含量的仪器。因其蛋白质含量测量计算的方法叫做凯氏定氮法，故被称为凯氏定氮仪，又名定氮仪、蛋白质测定仪、粗蛋白测定仪。
原理
将有机化合物与硫酸共热使其中的氮转化为硫酸铵。在这步中，经常会向混合物中加入硫酸钾来提中间产物的沸点。样本的分析过程的终点很好判断，因为这时混合物会变得无色且透明（开始时很暗）
在得到的溶液中加入少量氢氧化钠，然后蒸馏。这步会将铵盐转化成氨。而总氨量（由样本的含氮量直接决定）会由反滴定法确定：冷凝管的末端会浸在硼酸溶液中。氨会和酸反应，而过量的酸则会在甲基橙的示下用碳酸钠滴定。滴定所得的结果乘以定的转换因子就可以得到结果。
使用步骤
消化
1、准备6个凯氏烧瓶，标号。1、2、3号烧瓶中分别加入适当浓度的蛋白溶液1.0mL，样品要加到烧瓶底，切勿沾在瓶口及瓶颈上。再依次加入硫酸钾-硫酸铜接触剂0.3g，浓硫酸2.0mL，30%过氧化氢1.0mL。4、5、6号烧瓶作为空白对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质，对样品测定行校正。4、5、6号烧瓶中加入蒸馏水1.0mL代替样液，其余所加试剂与1、2、3号烧瓶相同。2、将加好试剂的各烧瓶放置消化架上，接好抽气装置。用微火加热煮沸，此时烧瓶内物质炭化变黑，并产生大量泡沫，务注意防止气泡冲出管口。待泡沫消失停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至溶液澄清后，再继续加热使消化液微沸15min。在消化过程中要随时转动烧瓶，以使内壁粘着物质均能流入底，以保证样品消化。消化时放出的气体内含SO2，具有强烈刺激性，因此自始自终应打开抽水泵将气体抽入自来水排出。整个消化过程均应在通风橱中行。消化后，关闭火焰，使烧瓶冷却至室温。
蒸馏吸收
蒸馏和吸收是在微量凯氏定氮仪内行的。凯氏定氮蒸馏装置种类甚多，大体上都由蒸气发生、氨的蒸馏和氨的吸收三分组成。
1、仪器的洗涤
仪器安装前，各件需经般方法洗涤干净，所用橡皮管、塞须浸在10%NaOH溶液中，煮约10min，水洗、水煮10min，再水洗数次，然后安装并固定在只铁架台上。仪器使用前，微量管道都须经水蒸气洗涤，以除去管道内可能残留的氨，正在使用的仪器，每次测样前，蒸气洗涤5min即可。较长时间未使用的仪器，重复蒸气洗涤，不得少于三次，并检查仪器是否正常。仔细检查各个连接处，保证不漏气。在蒸气发生器中加约2/3体积蒸馏水，加入数滴硫酸使其保持酸性，以避免水中的氨被蒸出而影响结果，并放入少许沸石（或毛细管等），以防沸。沿小玻杯壁加入蒸馏水约20mL让水经插管流入反应室，但玻杯内的水不要放光，塞上棒状玻塞，保持水封，防止漏气。蒸气发生后，立即关闭废液排放管上的开关，使蒸气只能入反应室，导致反应室内的水迅速沸腾，蒸出蒸气由反应室上端口通过定氮入冷凝管冷却，在冷凝管下端放置个锥形瓶接收冷凝水。从定氮发烫开始计时，连续蒸煮5min，然后移开煤气灯。冲洗毕，夹紧蒸气发生器与收集器之间的连接橡胶管，由于气体冷却压力降低，反应室内废液自动抽到反应室外壳中，打开废液排出口夹子放出废液。如此清洗2～3次，再在冷凝管下换放个盛有硼酸-示剂混合液的锥形瓶使冷凝管下口浸没在溶液中，蒸馏1～2min，观察锥形瓶内的溶液是否变色。如不变色，表示蒸馏装置内已洗干净。移去锥形瓶，再蒸馏1～2min，用蒸馏水冲洗冷凝器下口，关闭煤气灯，仪器即可供测样品使用。
2、无机氮标准样品的蒸馏吸收
由于定氮操作繁琐，为了熟悉蒸馏和滴定的操作术，初学者宜用无机氮标准样品行反复练习，再行有机氮未知样品的测定。常用巳知浓度的标准硫酸铵测试三次。取洁净的100mL锥形瓶五只，依次加入2%硼酸溶液20mL，次甲基蓝-甲基红混合示剂（呈紫红色）3～4滴，盖好瓶口待用。取其中只锥形瓶承接在冷凝管下端，并使冷凝管的出口浸没在溶液中。注意：在此操作之前须打开收集器活塞，以免锥形瓶内液体倒吸。准确吸取2mL硫酸铵标准液加到玻杯中，小心提起棒状玻塞使硫酸铵溶液慢慢流入蒸馏瓶中，用少量蒸馏水冲洗小玻杯3次，并放人蒸馏瓶中。然后用量筒向小玻杯中加入10 mL 30%NaOH溶液，使碱液慢慢流入蒸馏瓶中，在碱液尚未流入时，将棒状玻塞盖紧。向小玻杯中加约5mL蒸馏水，再慢慢打开玻塞，使半水流入蒸馏瓶，半留在小玻杯中作水封。关闭收集器活塞，加热蒸气发生器，行蒸馏。锥形瓶中的硼酸-示剂混合液由于吸收了氨，由紫红色变成绿色。自变色时起，再蒸馏3～5min，移动锥形瓶使瓶内液面离开冷凝管下口约lcm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，再继续蒸馏1min，移开锥形瓶，盖好，准备滴定。在次蒸馏毕后，移去煤气灯，夹紧蒸气发生器与收集器间的橡胶管，排除反应毕的废液，用水冲洗小玻杯几次，并将废液排除。如此反复冲洗干净后，即可行下个样品的蒸馏。按以上方法用标准硫酸铵再做两次。另取2mL蒸馏水代替标准硫酸铵行空白测定二次。将各次蒸馏的锥形瓶起滴定。
3、未知样品及空白的蒸馏吸收
将消化好的蛋白样品三支，空白对照液三支，依次作蒸馏吸收。加5mL热的蒸馏水至消化好的样品或空白对照液中，通过小玻杯加到反应室中，再用热蒸馏水洗涤小玻杯3次，每次用水量约3mL，洗涤液并倒入反应室内。其余操作按标准硫酸铵的蒸馏行。由于消化液内硫酸钾浓度而呈粘稠状，不易从凯氏烧瓶内倒出，须加入热蒸馏水5 mL稀释之，如果有结晶析出，须微热溶解，趁热加入玻杯，使其流入反应室。此外，还应当注意趁仪器洗涤尚未冷却时立即加入样品或空白对照液，否则消化液通过冷却的管道容易析出结晶，成堵塞。
滴定
样品和空白蒸馏毕后，起行滴定。打开接受瓶盖，用酸式微量滴定管以0.0100mol/L的标准盐酸溶液行滴定。待滴至瓶内溶液呈暗灰色时，用蒸馏水将锥形瓶内壁四周淋洗次。若振摇后复现绿色，应再小心滴入标准盐酸溶液半滴，振摇观察瓶内溶液颜色变化，暗灰色在二分钟内不变，当视为到达滴定终点。若呈粉红色，表明已越滴定终点，可在已滴定耗用的标准盐酸溶液用量中减去0.02mL，每组样品的定氮终点颜色须致。空白对照液接受瓶内的溶液颜色不变或略有变化尚未出现绿色，可以不滴定。记录每次滴定耗用标准盐酸溶液毫升数，供计算用。
缺陷
从凯氏定氮原理可以知道：凯氏定氮法是将含氮有机物转变为无机氮硫酸铵来行检测，以得到含氮量的测定值乘以定系数得出蛋白质含量。而含氮有机物不仅仅是蛋白质，还有三聚氰胺等等。在加上食品中蛋白质含量的现行标准和际通行测定方法是经典凯氏定氮法，这就为假者提供了可乘之机。蛋白质中的含氮量不过30%，三聚氰胺的的点是含氮量很（66%），溶于水后无色无味，也就是说在杯清水中加入三聚氰胺，然后用凯氏定氮法检测，结果显示是含有蛋白质的。由于“凯氏定氮法”只能测出含氮量,并不能鉴定饲料中有无违规化学物质,所以,添加三聚氰胺的奶粉理论上可以测出较的蛋白质含量。
