酵母基因组DNA提取试剂盒

酵母基因组DNA提取试剂盒

Yeast DNA Kit

●试剂盒内容及保存：

●储存条件和效期：

室温保存，12个月内有效。Proteinase K与Lyticase-20℃保存。缓冲液 YBL与缓冲液 YL可能有沉淀产生，37度水浴溶解后即可。

●产品简介：

酵母DNA提取试剂盒(Yeast DNA Kit)采用了一种新型的硅胶柱。在特定条件下，使DNA能在离心过柱的瞬间，结合到纯化柱上，在一定条件下又能将DNA充分洗脱，从而实现DNA的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀。纯化的DNA可直接用于PCR、Southern杂交和酶切等。

●准备工作：

1. 准备30℃，65℃，70℃水浴；无水乙醇；制冰机；1.5ml离心管；2ml离心管

2. 按照标签所示在DNA Wash Buffer中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3. 每次使用前请检查缓冲液YBL，缓冲液YL是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

●标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 取1-3 ml 酵母培养物（不超过3×10⁷酵母细胞），12,000 rpm (~13,400×g )离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

注：可用分光光度计或平板培养法检测菌体量，一般对于酿酒酵母OD₆₀₀值为1.0时，相当于1-2×10⁷cell/ml。

2. 加入480 μl 缓冲液 SE，完全重悬细胞。加入30μl Lyticase溶液。30℃水浴处理30min。期间振荡几次。

注意：以处理时间为经验值，根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同，孵育时间应该进行适当调整。

3. 4000 rpm(~1500×g)离心10钟，弃上清，收集沉淀。加入200μl 缓冲液 YL重悬。加入50mg Glass Beads，剧烈涡旋5min。

4. 加入20μl 蛋白酶K，混匀。65℃水浴孵育直至裂解完全，孵育过程中，涡旋几次。一般来说1小时以内能彻底裂解。

5. 可选步骤：加入5μl RNaseA并反复颠倒混匀，在室温条件下孵育5分钟。

6. 12,000 rpm (~13,400×g )离心1分钟，转移上清至新的离心管中。

7. 加入220 μl 缓冲液YBL，振荡15 秒，70℃放置10 分钟，溶液应变清亮。

注意：加缓冲液YBL 时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

8. 加220 μl 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

9. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

10. 向吸附柱中加入500 μl 缓冲液 WB，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

11. 向吸附柱 中加入600 μl DNA Wash Buffer（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。

12. 向吸附柱中加入600 μl DNA Wash Buffer，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

13. 12,000 rpm(~13,400×g)离心2 分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

14. 将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μl 洗脱缓冲液EB或灭菌去离子水，室温放置2-5分钟，12,000 rpm (~13,400×g ) 离心1分钟，将溶液收集到离心管中。

注：洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH 值在7.0-8.5 范围内(可以用NaOH将水的pH 值调到此范围)，pH 值低于7.0 会降低洗脱效率；

15. DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

●DNA浓度及纯度检测：

基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。提取的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。可配制0.8-1.0％琼脂糖凝胶，使用λ/HindIII判断基因组的大小，完整的基因组大小应在23kb以上。使用分光光度计检测时，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7–1.9之间，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水洗脱，比值可能偏低，但并不表明DNA纯度不高。

●常见问题分析：