植物多参数荧光与叶绿素荧光技术及应用

       Multiplex植物多参数荧光技术是一种新型的手持式植物荧光传感器技术，用于非破坏性测量植物生理状态相关的多种参数。Multiplex植物多参数荧光技术使用多种激发光源(UV、蓝、绿、红)来激发各种植物材料的荧光，比如叶片、针叶、作物、草地、果实、蔬菜、谷物等。它可以非破坏地同步测量20项参数(表1，Zhang, 2012)，比如花青素、黄酮和叶绿素的含量，叶绿素荧光激发比和UV(紫外)激发的蓝绿荧光(BGF)等。

　　表1. MULTIPLEX测量参数描述(Zhang, 2012)

　　这项技术被广泛应用于植物逆境生理研究;病虫害早期预测;施肥管理、蛋白含量预测;蔬菜品质及收获期判断;遥感，精准农业;次生代谢物质研究;葡萄酒、茶多酚、苹果多酚原料选择;其他水果等香气物质测量及收获期判断;中药有效成分分析及品种选育;芳香植物有效成分分析及品种选育;观赏植物如花卉、观叶植物等优良品种选育等研究和育种中。

　　Multiplex荧光技术可以快速无损地检测色素和无色的黄酮，而它们可以用来评估苹果的成熟度和品质。Betemps使用Multiplex荧光仪检测了三种不同品种的苹果，富士(Fuji)、澳洲绿苹果(Granny Smith)和金冠(Golden Delicious)(图1，Betemps, 2012)。

　　图1. A. 便携式Multiplex荧光仪 B. 富士(Fuji) C. 澳洲绿苹果(Granny Smith) D.金冠(Golden Delicious) 图2. ANTH、FLAV和CHL与花青素、黄酮和叶绿素实际含量的线性回归关系(Betemps, 2012)

　　结果发现，所有品种阳面的黄酮指数(FLAV)都要高于阴面。富士阳面的花青素指数(ANTH)要高于阴面。而绿苹果和金冠阴面的叶绿素指数(CHL)要高于阳面。与破坏性方法萃取苹果皮测量得到的花青素、黄酮和叶绿素含量相比，ANTH、FLAV和CHL都与其有极好的线性回归关系(图2)。而苹果糖分含量与叶绿素荧光的远红光谱带之间发现了负相关关系。

　　Cerovic则使用MULTIPLEX荧光仪为波尔多一处葡萄园中每一株葡萄描绘了一张花青素和黄酮地图(图3，Cerovic，2009)。

　　图3. Multiplex荧光仪 A)在田间进行测量;B)荧光仪顶视图;C)光学探头前视图，可见LED光源(6个UV和3个RGB)和中间的3个检测器(YF，FRF，RF)(Cerovic，2009)

　　他们希望通过使用Multiplex技术进行多年的研究，从而描述葡萄品质特性的变化。初步研究中发现花青素和葡萄产量间存在弱相关性。由于土壤特性的差别，造成了每一个小样地之间都会存在差异(图4)。

　　图4. 反映果实特性的Multiplex参数的空间变化图(Cerovic，2009)

　　叶绿素荧光中包含了可以深入反映植物光合系统电子传递链状态的大量信息。因此从上世纪70年代开始，叶绿素荧光技术就逐渐成为一种极为重要的植物生理研究技术。而FluorCam叶绿素荧光成像技术正是这一技术最先进的代表。关于FluorCam叶绿素荧光成像技术的详细介绍请见《FluorCam叶绿素荧光成像技术及其应用》。

　　由于叶绿素荧光技术可以直接反映植物的受胁迫状况，因此经常与Multiplex植物多参数荧光技术联合应用在研究中(Tremblay，2012)。Suthaparan在研究UV-B对黄瓜白粉病影响时，就同时使用了Multiplex荧光仪和叶绿素荧光仪。分别测量不同时间UV-B照射后，花青素、黄酮和叶绿素荧光参数Fv/Fm的差异(表2，Suthaparan，2014)。

　　表2. 黄瓜感染白粉病并照射不同时间UV-B后的花青素、黄酮和叶绿素荧光参数Fv/Fm (Suthaparan，2014)

　　表2. 黄瓜感染白粉病并照射不同时间UV-B后的花青素、黄酮和叶绿素荧光参数Fv/Fm (Suthaparan，2014)

　　FluorCam叶绿素荧光成像技术尤其是其独有的多光谱荧光成像技术不但可以测量叶绿素荧光参数并成像，而且能够测量Multiplex中的绝大部分参数并成像，同时还具备许多MULTIPLEX和传统叶绿素荧光技术不具备的功能。

　　FluorCam系列叶绿素荧光成像系统中可以进行MCF成像分析的系统有FluorCam封闭式多光谱荧光成像系统，FluorCam开放式多光谱荧光成像系统和FKM多光谱荧光动态显微成像系统。FluorCam封闭式多光谱荧光成像系统和FluorCam开放式多光谱荧光成像系统都具备三种激发光：红色、蓝色和紫外光，同时内置7位滤波轮和相应光学滤波器，不仅可以进行一般的叶绿素荧光成像分析，还可进行 UV-MCF 荧光成像分析和GFP荧光蛋白等成像分析。同时，FluorCam开放式多光谱荧光成像系统由于其独特的模块式组合，具备多功能、高灵活性和高度扩展性能，还可选配绿色光源、青色光源等各种LED激发光源，对其它荧光蛋白与荧光染料如BFP、CFP、YFP等荧光蛋白进行荧光成像分析研究。

　　图5. FluorCam封闭式多光谱荧光成像系统

　　图6. FluorCam开放式多光谱荧光成像系统

　　FKM多光谱荧光动态显微成像系统则是目前功能最为强大全面的藻类/植物显微荧光研究仪器，不仅可以进行微藻、单个细胞、单个叶绿体甚至基粒-基质类囊体片段进行Fv/Fm、Kautsky诱导效应、荧光淬灭、MCF多光谱荧光、OJIP快速荧光响应曲线、QA再氧化等各种荧光成像动力学分析;还能通过激发光源组进行任意荧光激发和荧光释放波段的光谱分析测量，从而进行藻青蛋白、藻红蛋白等藻类特有光合色素的成像分析;更可以利用光谱仪对各种激发光和荧光进行光谱分析，区分各发色团(例如，PSI和PSII及各种捕光色素复合体等)以及MCF全光谱图分析。除对叶绿素荧光动态进行成像光谱分析外，还可对静态荧光如GFP荧光、DAPI荧光、DiBAC4荧光、SYTOX 绿色荧光、CTC荧光染色等荧光蛋白、荧光素进行成像分析。

　　图7. FKM多光谱荧光动态显微成像系统

　　由于FluorCam多光谱荧光成像系统具备红光、蓝光、绿光、UV等多种光源和相应的滤波器，因此使其不但可以测量和计算Multiplex技术中相应的参数，而且可以通过CCD成像反映植物不同部位的细微差异，测量样品范围扩展到了整株植物到微藻、单个细胞、单个叶绿体甚至基粒-基质类囊体片段。

　　Pineda使用辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)的两种不同毒株感染Nicotiana benthamiana。结果发现BGF成像能在检测到病毒之前就发现病毒引起了叶片变化。而叶绿素荧光则验证了病毒感染对植物光合系统的影响。荧光比率F440 ? F690 和F440 ? F740在感染后明显增加(图8)。Pineda认为这两项参数是生物胁迫检测的极佳指标(Pineda，2008)。此研究中测量了F440、F520、F690、F740。其中F440、F520即为将Multiplex中BGF-UV以更高的光谱分辨率分为了绿色和蓝色荧光(BGF即为蓝/绿荧光的缩写);F690即为RF-UV;F740即为FRF-UV。如果使用其他蓝色、红色或者绿色光源进行激发，即可测得Multiplex其他荧光参数并据此计算叶绿素指数、黄酮指数和花青素指数等。

　　图8. 感染 PMMoV 的Nicotiana benthamiana的 F440 ?F520，F440 ?F690，F440 ? F740和F690 ?F740荧光比率图(Pineda，2008)

　　参考文献：

　　1.Zhang Y P, et. al, 2012, A first comparison of Multiplex? for the assessment of corn nitrogen status, Journal of Food, Agriculture & Environment, 10 (1): 1008-1016

　　2.Betemps, et. al, 2012, Non‐destructive evaluation of ripening and quality traits in apples using a multiparametric fluorescence sensor, Journal of the Science of Food and Agriculture, 92(9):1855–1864

　　3.Cerovic Z G, et. al, 2009, Mapping winegrape quality attributes using portable fluorescence-based sensors, Frutic, 9:301-310

　　4.Tremblay N, et. al, 2012, Sensing crop nitrogen status with fluorescence indicators. A review, Agron. Sustain. Dev., 32:451–464

　　5.Suthaparan A, et. al, 2014, Suppression of Cucumber Powdery Mildew by Supplemental UV-B Radiation in Greenhouses Can be Augmented or Reduced by Background Radiation Quality, Plant Disease, 98(10):1349-1357

　　6.Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060